抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP 微板法)的产品介绍_公司新闻_生物化学试剂易购商城－－－

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP 微板法)的产品介绍

产品简介：

酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜 pH 值为 4.5～5.5；存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)

均在细胞滤泡中，并不是释放入血液，血液中的 TRAP 绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的 TRAP 了解破骨细胞的功能状态，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标，TRAP 是一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞

(chondroclast)中高表达，在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP 微板法)(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用 p-nitrophenyl phosphate (pNPP) 为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下可在 ACP 的作用下生成 p-nitrophenol (p-NP)；在碱性条件下 p-NP 呈黄色，黄色越深说明 ACP 活性越高，反之则酶活性越低，在 400～415nm 处有最大吸收；在适量的酒石酸存在的情况下进行 ACP活性检测，得到的 ACP 活性就是 TRAP 的活性，根据 p-NP 的生成量即可计算出 TRAP 的活性水平，可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的TRAP 活性。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品：

①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，用于 TRAP 的检测。

②细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在 106 以上，组织应在 100mg 以上，3000~4000g 离心取上清， -20℃冻存，用于 TRAP 的检测。

③植物样品：取适量的植物组织加入少量 PBS 或生理盐水，充分捣碎或研磨，静置 30min，用纱布或滤纸过滤，4000g 离心 20min，留取上清液并测量体积，-20℃冻存，

用于 TRAP 的检测。

④高活性样品：如果样品中含有较高活性的 TRAP，可以使用 ACP Assay Buffer、PBS

或生理盐水稀释后再行检测。

2、配制显色工作液：取出 1 支 pNPP，恢复至室温后溶解于 2.5ml ACP Assay Buffer，

混匀，冰上预冷备用，新配制的显色工作液应在 6h 内用完。

3、配制系列标准品：取出 p-nitrophenol(10mM)恢复至室温，离心机 10000rpm 离心 5min，按p-nitrophenol(10mM)：ACP Assay Buffer=1：19的比例混合，使浓度达到0.5mM，-20℃冻存备用；按下表继续稀释：

5、TRAP 测定：轻轻混匀，37℃孵育 25～30min，每孔加入 160μl Stopping Solution

终止反应；以空白调零，酶标仪测定 405nm 处标准管、测定管的吸光度。

计算：

系列标准品(1~6 号)浓度(即 p-NP 含量)0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02

μM 为横坐标，以对应的标准孔吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，根据测定孔的吸光度在标准曲线上查得待测样品 p-NP 的生成量。酸性磷酸酶活性单位的定义：在 pH 值 4.8 37℃条件下，每分钟水解 pNPP 显色底物产生 1 μM p-NP 所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位，根据酶活性定义，计算出样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。TRAP 酶活性(μM/min)=待测样品 p-NP 生成量/孵育时间

注意事项：

1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、如果待测样品体积较少，可减少样品加样量，以 ACP Assay Buffer 补至 30μl。

3、如果无法检测 405nm，亦可检测 400～415nm 范围内吸光度。

4、建议每次测定时都最好作标准曲线，以使标准更准确，另外标准品避免反复冻融。

5、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测

体积，尽量采用小体积的比色杯。

6、所测样品的含量高于标准曲线的上限，应用 ACP Assay Buffer 稀释样品后重新测定。

7、配制 1 支显色工作液后应当日用完，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。

8、p-nitrophenol 溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。

9、如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育 30min或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。

10、待测样品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至 30min。