RT-PCR实验代测
多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是美国 Perkin-Elmer/Cetus公司人类遗传研究室Mullis K. B.等人于1985年发明的一种快速体外DNA片段扩增技术，是八十年代分子生物学资源领域的一项革命性突破，被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。该技术一问世，就在分子生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等领域得到快速而广泛的应用，并且对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展也起了巨大的推动作用。
PCR技术是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术（亦称无细胞分子克隆技术）。它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸作为介导，通过DNA聚合酶促反应，在体外进行特异DNA序列扩增。其过程包括模板变性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在内的重复循环系列，使末端被引物5’端限定的特异性片段成指数形式累积。由于在每一循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长。因此20次PCR循环将产生约一百万倍（220）的扩增产物，具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强的特点，并且具有从DNA粗制品和降解的 DNA模板中扩增靶序列的能力，这一点在生药鉴定应用中尤为重要。
PCR的原理类似于DNA的天然复制过程，关键是运用两个起始引物，分别为待扩增序列的相对的两条单链DNA结合，结合位点分别位于待扩增序列的两端，并且3’端相对，然后利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制，在两个引物之间诱发聚合酶反应。PCR反应可以简述如下：
在微量离心管中加入适量缓冲液，加微量模板DNA，四种脱氧单核苷酸（dNTP），耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+存在。
1、加热使模板DNA在高温下（95℃左右）变性，双链DNA解开而变成单链DNA游离于溶液中。这是所谓变性阶段。
2、PCR的引物是两段人工合成的寡核苷酸链，长度为16－24个核苷酸残基，其顺序由被扩增的DNA片段两端的序列决定。这两段寡核苷酸 链分别与模板DNA的正链和负链互补，所互补的位点一个在被扩增序列的“上游”，一个在被扩增序列的“下游”。高温使模板DNA变性成单 链以后，温度降低，由于PCR反应体系中引物的拷贝数远远多于模板DNA的拷贝数，因而引物与模板 DNA形成复合物的机率要大大高于 模板DNA两条单链的重新结合。只要严格地控制复性的条件，复性过程是倾向于形成引物与模板的复合物的。这是退火阶段。
3、溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两 条双链。这是延伸阶段。
如此重复，改变反应温度，即高温变性，低温退火，中温延伸三个阶段。这三次改变温度为一个循环。每循环一次，使特异区段基因拷贝数扩大一倍，一般30次循环，基因放大数可达2n倍。可用公式
Y＝（1＋X）n
表示，式中Y＝DNA扩增倍数，X＝扩增效率，循环数为n。
如X＝100%，n＝20时，Y＝1048576倍。但实际扩增效率（X）不会达到 100%。
2 试验条件
本程序适用于自动PCR操作，可适用于大多数情况，所用酶是不含核酸外切酶活性的热稳定聚合酶，如Taq聚合酶等。
引物（各50pmol）
0.2mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等）
模板DNA：约0.05～1mg基因组DNA或0.002～0.02mg质粒DNA
Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）
10×PCR缓冲液（500mmol/L KCl，15mmol /L MgCl2，100mmol/L Tris·HCl，pH 8.3）
矿物油
电泳所需试剂
【仪器设备】
PCR扩增仪
电泳装置
微量离心机
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5ml Eppendorf 管
紫外线观察装置及照相设备
2.2.2.3 操作程序
1．在无菌的Eppendorf管内加入以下反应物：
2．93℃ 反应2 min后开始以下循环：
93℃变性反应1 min；
50℃退火反应1 min；
72℃延伸反应3 min。
经过17～35循环后，最后一个循环72℃增加5 min。循环结束后反应产物置于40℃保存。
3．取1～5ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。
2.2.2.4 应注意的问题及其解决方法
1．PCR反应条件的优化
要优化特定的PCR反应，有必要试用不同的反应组分和循环参数。表2-1列出了添加或改变某一试剂浓度对反应结果的影响，从中大家可以得到一些线索以改进反应条件，提高PCR产量和/或特异性，一般情况下，只须改变一两个参数就行了，如pH值和MgCl2浓度。表2-2给出了循环参数对PCR结果的影响。
表2-1 PCR各反应组分浓度对产物特异性和产量的影响
| 反应组分 | 提高产量 | 提高特异性 |
| 模板浓度 | 增加 | 减少 |
| 引物浓度 | 高至75 pmol | 低至15 pmol |
| 引物长度 | － | 增加 |
| dNTPs | 各1 mmol/L | 各20 mmol/L |
| Tris-HCl (10 mmol/L pH8) | pH高至10* | pH高至10* |
| MgCl2 | 高至4 mmol/L | 1.5 mmol/L |
| DMSO | － | 10%** |
| 甘油 | － | 2% |
| 甲酰胺 | － | 5% |
| Taq DNA聚合酶*** | 高至5U | 0.5U |
* 效果可能不可预测
** 添加10% DMSO时，Taq DNA聚合酶的活性会被抑制47%，因此反应加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以补偿
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改变以提高PCR产物的特异性和/或产量的循环参数
| 反应条件 | 提高产量 | 提高特异性 |
| 循环数 | 最多35个 | 减至25个 |
| 变性* | 增至1 min | － |
| 引物退火** | 降至45℃ | 升至72℃ |
| 引物延伸*** | 在后期循环中延长 | 维持30s |
* 使用基因组DNA作模板时，开始几个循环变性应于97℃进行
** 假定Tm值为60℃
*** 延伸时间依产物大小而定：1000bp的产物延伸30s即可，产物更长时，按每1000 bp延伸0.5 min计，在后期循环中增加延伸时间可以提高扩增效率
2．引物的设计
毫无疑问，引物的碱基组成，长度及其靶序列的同源性是决定PCR成败的首要因素，选择设计引物在一定程度上仍然要靠经验，对于某一对引物而言尚无通用的规则可严，但应遵守以下原则：
（1）一般性原则：
①长度：15～30bp，其有效长度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度（74℃），从而降低产物的特异性。
②G＋C含量：应在45%～55%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5～10度。引物长度小于20时，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。
③ 碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现3个的连续的G或C，否则会使引物在G＋C富集序列区错误引发。
④ 引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
⑤引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
⑥特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70%，或少于连续8个的互补碱基。
（2）引物的3’端：
引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应，除特殊情况（AS-PCR）外，3’端不应发生错配。S. Kwok等发现，引物的3’端发生错配时，A:A使产量下降至1/20，A:G或C:C下降至1/100。当末位碱基是T时，即使错配也能引发链的合成，而为A时错配的引发效率最低，G、C居间。
因此，引物的3’端碱基最好选用A、G、C，而尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T。
此外，如果扩增编码区域，引物的3’端不要终止于密码子的第3位，因此处易发生简并，从而影响扩增特异性。
（3）避开引物的二级结构区：
某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响，因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区，有些计算机软件可帮助确定该区域，如不能避开，则可用7- deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP，有助于PCR成功。
目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并依据上述原则对所选用引物进行评价。
3．出现异常结果时的解决思路
在做PCR反应的过程中，由于其酶促反应的本质，影响最终结果的因素较多，所以出现一些非预料的结果是可以理解的。下面简单地总结一下在PCR反应结果出现异常时我们应该采取的措施。
（1）电泳检查没有 PCR产物
a．需检查一下Taq DNA聚合酶是否失活，或是活性太低，还需查一下在加样过程中是否向体系中加过Taq DNA聚合酶；
b．需检查一下所使用的引物，看其序列设计是否正确，是否碱基组成不平衡；
c．需要检查一下PCR反应过程中模板是否变性充分，尤其在前几个循环中是否变性充分；可以适当地提高模板变性的温度或是适当延长变性的时间；
d．需检查一下在PCR反应体系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制剂，如SDS污染等等；
e．需检查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染，可以预先加热使之失活。
（2）电泳检查出现引物二聚体区带
a．需检查一下两个引物的3’端是否互补，或者是否有相类似的回文结构；
b．需检查一下使用的引物是否太短，可以予以适当的延长；
c．需检查模板的用量，模板以10－4个拷贝为最佳，模板太少会造成引物相对过量；
d．适当地降低引物的浓度，引物浓度过高是出现引物二聚体的最主要原因；
e．循环次数太多也易形成引物二聚体，可以适当地减少循环数；
f．可以将复性温度提高一些以减少引物二聚体形成。
（3）电泳检测PCR产物呈片状（smear）
a．需检查一下Taq DNA聚合酶的用量，适当地减少Taq酶的量有助于特异性条带扩增；
b．可以提高反应的退火温度，或者直接采用两个温度的PCR（68℃退火和延伸，94℃模板变性）；
c．适当地降低Mg2+的浓度也可起到降低非特异性扩增可能性的作用；
d．适当地减少反应退火的时间和延伸的时间；
e．适当地减少循环次数也会有效果；
f．可以尝试使用巢式引物PCR（nested primer PCR）。
（4）电泳检测PCR产物出现其它非特异性条带
a．需检查一下引物的3’端是否有连续排列的G或C；
b．可以适当地提高退火温度或直接采用两步温度PCR方法进行扩增；
c．可以降低Taq DNA聚合酶的用量，同时也降低引物的浓度；
d．可以适当地减少退火所用的时间以及延伸反应的时间；
e．可以适当地增加或减少一些Mg2+浓度。
4．假阳性
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。
预防各种污染的措施主要有：（1）工作区隔离。（2）改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。（3）操作程序合理化，如后加阳性对照等。
交叉污染的处理方法包括：（1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR产物。一般选用波长254nm照射30min（Nature, 1990, 34:27）。（2）PCR实验中使用dUTP，而不用dTTP。在扩增前使用UraciⅠN-glycosylase（尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的PCR产物，而不降解基因组DNA模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（Gene, 1990, 93: 125）。美国PE公司提供此类试剂盒（PCR carry-over preventionkit）。（3）在PCR反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联 DNA链，使之不能再扩增（Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99）。
2.2.2.5 PCR技术在分子生药学中的应用
对于生药学家来说，PCR技术已称为他们研究生药的一种崭新而有力的工具。PCR技术在生药学中的应用主要有两方面：①扩增和直接测序或者对属性特异的DNA序列定性以用于系统发育或亲缘关系的分析，也可用于鉴定品种；②通过简单纯化从复杂生物样品的混合物中鉴定病原体和土壤微生物，用于药用植物的基因工程。
